کلونینگ و توالی یابی ژن p- انسولین جدا شده از گیاه دارویی Momordica charantia و تحلیل بیوانفورماتیکی ساختار سه بعدی پروتئین

چکیده سابقه و هدف: دیابت بیماری است که بدن توانایی کنترل قند خون را از دست می دهد. داروهای شیمیایی تجویز شده به منظور درمان قند خون دارای اثرات جانبی نامطلوب متعددی هستند. در این زمینه داروهای گیاهی جایگزین بسیار مناسبی میباشند چون اثرات جانبی بسیار کم تری دارند. گیاه کارلا با نام علمی Momordica charantia از خانواده Cucurbitaceae می باشد. بذرهای کارلا دارای پلی پپتیدی به نام p-انسولین می باشد که از 172 اسید آمینه تشکیل یافته است. مقدار p-انسولین بسته به بافت گیاه، رقم، محل کشت و فصل برداشت بسیار متغیر است و در مجموع مقدار آن نسبتا پایین میباشد بطوریکه این میزان برای تولید صنعتی داروها بر پایه این ترکیب کافی نیست. علاوه بر این به دلیل وجود ترکیبات مداخله گر مانند پلی ساکارید ها، ممکن است این ماده موثره تاثیر کمتری داشته باشد. کلون کردن ژن p- انسولین و بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم ها، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p- انسولین از گیاه کارلا از طریق RT-PCR شناسایی و سپس توالی یابی شد. مواد و روش ها: به منظوراستخراج RNA ، در دو مرحله نارس و رسیده از فرابر، آریل بذر و بذر گیاه کارلا نمونه گیری انجام شد. کمیت و کیفیت RNA استخراج شده از طریق دستگاه اسپکتروفوتومتری و الکتروفوز بر روی ژل TBE 1% تعیین شد. سپس جهت کلونینگ ژن p-انسولین، RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن p-انسولین انجام شد. سپس محصول RT-PCR ژن p-انسولین ، از طریق ژل الکتروفورز خالص سازی و کلونینگ ژن p-انسولین در تی وکتور صورت گرفت. پس از استخراج پلاسمید نوترکیب و تایید حضور ژن p-انسولین در تی وکتور، پلاسمید نوترکیب تعیین توالی شد. در ادامه ساختار سه بعدی پروتئین p-انسولین از طریق مدلینگ به کمک نرم افزار Phyre 2.0 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) بررسی شد. یافته ها: در نتایج بدست آمده ازالکتروفورز RNA از بافت های مختلف کارلا، وجود دو باند مربوط به 28SrRNA و 18SrRNA نشان دهنده استخراج موفق RNA بود. نتایج RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن p-انسولین باند اختصاصی bp750 موید تکثیر صحیح cDNA بود. همچنین، بیان ژن p-انسولین در بافت آریل بذر رسیده بیشتر از سایر بافت های میوه بود. پس از خالص سازی باند مربوط به ژن p-انسولین ، واکنش لیگاسیون ژن هدف در داخل تی وکتور و ترانسفورماسیون آن به داخل میزبان E. coli صورت گرفت که نتایج مثبت موید انجام موفق کلونینگ بود. در ادامه تعیین توالی ژن p-انسولین، از گیاه دارویی کارلا برای اولین بار در ایران انجام شد. نتایج بیوانفوماتیک نشان داد که دومین های فعال منواکسیژناز متصل شونده به FDA در بخش N ترمینال و پرولیپوپروتئین دی آسیل گلیسریل ترانسفراز در C ترمینال پروتئین p- انسولین وجود دارد. نتیجه گیری: بیان کم پروتئین p- انسولین در گیاه کارلا و وجود ترکیبات مداخله کننده مانند پلی ساکاریدها ممکن است باعث کاهش تاثیر ماده موثره کاهنده قند خون می شود. لذا، در این تحقیق ژن p- انسولین از گیاه کارلا کلون و تعیین توالی شد. تعیین توالی ژن p- انسولین امکان بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم و تولید فراوان و خالص پروتئین p- انسولین را به عنوان دارو فراهم خواهد کرد. واژه های کلیدی: Momordica charantia، دیابت، کلونینگ، توالی یابی، بیوانفورماتیک